紫外可見吸收光譜主要產(chǎn)生于分子價(jià)電子在能級間的躍遷。利用一定頻率的紫外--可見光照射被分析的物質(zhì)，引起分子中價(jià)電子的躍遷，它將有選擇地被吸收。吸收光譜可以反映出物質(zhì)的特征。它對物質(zhì)進(jìn)行定性分析、定量分析及結(jié)構(gòu)分析, 所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜。

按所吸收光的波長區(qū)域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。

溶液對光的作用示意圖：

溶液對光吸收示意圖：

光吸收遵循朗伯-比爾定律：

I0--入射光輻射強(qiáng)度、I-- 透射光輻射強(qiáng)度、T --透射比、a--吸光系數(shù)、ε--摩爾吸光系數(shù)。

組成：光源、單色器，狹縫、樣品池、檢測器

1．光源：

　?、倌芴峁┻B續(xù)的輻射；②光強(qiáng)度足夠大；③在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長有明顯變化；④光譜范圍寬；⑤使用壽命長，價(jià)格低。 鎢燈——可見光區(qū) 320～2500nm

      氫燈或氘燈——紫外光區(qū) 195－375nm

2．單色器：包括狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件

　　單色器是分光光度計(jì)的心臟部分，它的作用是把來自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長。它的主要組成部件和作用是：

    ①入射狹縫——限制雜散光進(jìn)入。

    ②色散元件——即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。 ③準(zhǔn)直鏡——把來自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。 

    ④出射狹縫——只讓特定波長的光射出單色器。

3. 吸收池

     玻璃—由于吸收紫外UV光，僅適用于可見光區(qū)；石英—適用于紫外和可見光區(qū)。

4    檢測器

        檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴，F(xiàn)今使用的分光光度計(jì)大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。

5．記錄裝置：常用的信號顯示裝置有直讀檢流計(jì)，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動記錄和數(shù)字顯示裝置等。

按其光學(xué)系統(tǒng)可分為單波長分光光度計(jì)和雙波長分光光度計(jì)。

單波長單光束分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：使用時(shí)來回拉動吸收池、對光源要求高、比色池配對

單波長雙光束分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：不用拉動吸收池、可以減小移動誤差、對光源要求不高、

可以自動掃描吸收光譜。

雙波長分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：

利用吸光度差值定量、消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差。

一、 儀器測量條件的選擇

 1.適宜的吸光度范圍

由朗伯-比爾定律可知：

                               A=lg1/T=εcl  

微分后得：

                     dlgT=0.4343dT/T= -εldc

                    或    0.4343ΔT/T= -εlΔc

代入朗伯-比爾定律有：

                Δc/c=0.4343ΔT/TlgT

要使測定的相對誤差Δc/c最小，求導(dǎo)取極小得出：

                       lgT=-0.4343=A

即當(dāng)A=0.4343時(shí)，吸光度測量誤差最小。 

最適宜的測量范圍為0.2~0.8之間。

二、入射光波長的選擇

 通常是根據(jù)被測組分的吸收光譜，選擇最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長為入射波長。當(dāng)最強(qiáng)吸收峰的峰形比較尖銳時(shí)，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強(qiáng)峰或肩峰進(jìn)行測定。 

三、狹縫寬度的選擇

為了選擇合適的狹縫寬度，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)試樣的吸光度不再增加為準(zhǔn)。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。

四、顯色反應(yīng)條件的選擇

對多種物質(zhì)進(jìn)行測定，常利用顯色反應(yīng)將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸收的物質(zhì)。常見的顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等。這些顯色反應(yīng)，必須滿足以下條件：

1．反應(yīng)的生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強(qiáng)的吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；

2．反應(yīng)有較高的選擇性，即被測組分生成的化合物吸收曲線應(yīng)與共存物質(zhì)的吸收光譜有明顯的差別；

3.  反應(yīng)生成的產(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性，以保證測量過程中溶液的吸光度不變；

4.反應(yīng)生成物的組成恒定。

五、參比溶液的選擇

測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差。參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有：

1．溶劑參比：試樣簡單、共存其它成分對測定波長吸收弱，只考慮消除溶劑與吸收池等因素

2．試樣參比：如果試樣基體溶液在測定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時(shí)，可按與顯色反應(yīng)相同的條件處理試樣，只是不加入顯色劑。

3．試劑參比：如果顯色劑或其它試劑在測定波長有吸收，按顯色反應(yīng)相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。

4.  平行操作參比：用不含被測組分的試樣，在相同的條件下與被測試樣同時(shí)進(jìn)行處理，由此得到平行操作參比溶液。